Учёные разработали новый способ массовой проверки генов в тканях человека
Наука и космос019:48
Исследователи создали метод, позволяющий одновременно анализировать активность отдельных генов в объёме выращенной человеческой ткани. Эта технология сочетает в себе редактирование генома с помощью CRISPR и органоиды — трёхмерные модели мини-органов, сформированные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Новый подход сделал возможным выявление генов, критически важных для формирования нервной системы на ранних стадиях эмбрионального развития.
Работа, опубликованная в журнале eLife, который охарактеризовал исследование как одно из первых широкомасштабных исследований, раскрывающих механизмы человеческого развития с использованием эмбриональных моделей, была выполнена группой, возглавляемой учеными из Гарварда. Эксперименты на людях ограничены этическими и техническими аспектами, поэтому исследователи использовали органоиды — конструкции, способные воспроизводить отдельные этапы формирования тканей в лабораторных условиях.
Основная сложность существующих методов генетического анализа органоидов заключается в неоднородности изменений. При попытке отключить конкретный ген только часть клеток получает необходимую модификацию, что приводит к образованию «мозаики» из различных клеточных групп внутри одного органоида. Это затрудняет понимание того, как определённый ген влияет на развитие всей ткани. Новая технология позволяет подавлять активность отдельных генов одновременно во всех клетках органоида.
Для этого команда модифицировала стандартный процесс подготовки CRISPR-инструментов. Обычно создание нужной генетической конструкции требует нескольких последовательных шагов, включая выделение и выращивание отдельных клеточных клонов. Учёные объединили несколько этапов и провели тщательную очистку ДНК на начальной стадии, что позволило избежать длительного отбора отдельных клонов. Полученные генетические конструкции затем вводились в клетки с помощью вирусных векторов.
Кроме того, исследователи оптимизировали процесс производства этих вирусных векторов. Они обнаружили, что уменьшение объёма питательной среды во время роста клеток увеличивает выход вирусных частиц, а добавление вируса одновременно с размещением стволовых клеток на питательной поверхности значительно улучшает эффективность доставки генетических конструкций. В результате модификацию получали почти все человеческие плюрипотентные стволовые клетки.
Для проверки возможностей метода учёные выбрали 77 генов и создали на их основе органоиды нервной ткани. Они уделили особое внимание процессу формирования нервной трубки — структуры, из которой в ходе эмбрионального развития формируются головной и спинной мозг. Нарушение этого этапа может привести к анэнцефалии — тяжёлому врождённому дефекту, при котором головной мозг развивается неправильно.
Анализ показал, что подавление трёх генов — ZIC2, SOX11 и ZNF521 — приводит к значительным нарушениям формирования нервной трубки. В органоидах с отключёнными ZIC2 и SOX11 нервная пластинка оставалась полностью открытой, в то время как при снижении активности ZNF521 наблюдались множественные участки неправильного закрытия. Дополнительный анализ показал, что эти гены регулируют не отдельные процессы, а целые группы других генов, участвующих в развитии нервной системы.
По словам авторов, созданная платформа значительно сокращает время и стоимость масштабных генетических экспериментов и позволяет проводить исследования, которые ранее были практически недоступны для тканей человека. Новый подход может помочь в обнаружении молекулярных причин врождённых нарушений развития и выявлении потенциальных мишеней для будущих методов лечения.
Darth SaharaИсточники:eLifeНаука и космос0Стволовые клеткиCRISPRГеном человекаОрганоидыГенетический скринингЭмбриональное развитие19:48
Источник