Начальное плавление ДНК зафиксировали с точностью до пары оснований
Наука и космос022:26
Исследователи впервые смогли детально наблюдать за процессом активации репликации ДНК в живых клетках с точностью до отдельных пар оснований.
Перед делением клетка обязана полностью скопировать свой геном. Для этого задействуются специализированные белковые моторы — хеликазы (helicase, от лат. helix — спираль), ферменты, которые разделяют две цепи двойной спирали ДНК. Главный «молекулярный мотор» — хеликаза, расплетающая двойную спираль ДНК на две отдельные цепи перед делением клетки — комплекс MCM2-7.
Этот комплекс состоит из шести различных белков-субъединиц (от Mcm2 до Mcm7). В неактивном состоянии MCM2-7 формирует двойное кольцо вокруг ДНК в конкретных точках старта. Ранее эксперты не могли точно зафиксировать в живой клетке момент, когда эти два кольца разделяются, где именно начинается расплетение ДНК и как одна из цепей выходит наружу.
Чтобы поэтапно зафиксировать переходный процесс, авторы исследования использовали методы химической генетики на клетках дрожжей. С помощью молекулярных защёлок специалисты соединили соседние субъединицы белка Mcm4 одного кольца и Mcm5 другого. Блокирование физического разделения колец привело к остановке клеточного цикла и снижению синтеза ДНК более чем на 70% через 60 минут после выхода из фазы покоя G1.
Это продемонстрировало, что механический разрыв двойного кольца (гексамера) является строгим условием для своевременного высвобождения белков-активаторов Sld3 и Mcm10.
Изучение всех шести потенциальных интерфейсов белкового кольца показало, что функцию молекулярных ворот для выхода одной из цепей ДНК выполняет стык субъединиц Mcm2/5. Блокировка этого участка позволяет осуществить начальное плавление молекулы, но полностью останавливает дальнейшую элонгацию (продление синтеза), поскольку две активированные хеликазы физически не могут пройти мимо друг друга с закрытыми воротами.
Нарушение функционирования этого интерфейса оказалось летальным для клеток.
Применяя методы геномного картирования высочайшего разрешения (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq), специалисты установили, что первичное расплетение спирали начинается точно в центре — в месте контакта двух белковых колец. Структура ДНК в этой области устроена особым образом: её плотный центральный участок окружён фрагментами, которые легко поддаются разрыву. Благодаря такой архитектуре спираль быстро деформируется и расходится под физическим давлением белкового мотора.
Анализ одноцепочечной ДНК показал появление первых расплетённых участков через 15 минут после перехода клеток в фазу синтеза ДНК. Авторы исследования проследили, как область контакта белка с ДНК расширяется с 64 пар оснований до промежуточных значений в 72 пары оснований и затем до 138 пар оснований при разделении колец и привлечении ферментов-полимераз.
Исследование впервые объединило разрозненные шаги начала копирования ДНК в единую поэтапную карту: от расхождения белковых колец и выталкивания одиночной нити через молекулярные ворота до разделения копирующих комплексов в разные стороны. Поскольку эти основные белки имеют одинаковую структуру у дрожжей и человека, понимание точной механики процесса позволит выяснить, как клетки поддерживают стабильность генома и почему сбои на этапе удвоения ДНК могут приводить к опасным мутациям.
Darth SaharaИсточники:Nature CommunicationsНаука и космос0Молекулярная биологияГенетикаБиохимияГеномБиофизикаРепликация ДНК22:26
Источник